尽管FITC仍然是制备绿色荧光生物复合物zui常用的荧光标记染料，但是FITC也存在一定的局限性，如显微镜成像的严重光漂白和pH敏感荧光。用iFluor制备蛋白质结合物™ 488染料远远优于荧光素衍生物的共轭物，如FITC。iFluor 488共轭物明显比荧光素共轭物更亮，并且更容易光照。

另外，iFluor的荧光™ 488不受pH（4-10）的影响。这种pH不敏感是对荧光素的一个重大改进，荧光素只有在pH高于9时才会发出zui大的荧光™ 488se染料稳定，与蛋白质氨基具有良好的反应性和选择性。这个iFluor™ 488具有与Alexa Fluor®488 NHS酯类似的光谱性质和反应活性（Alexa Fluor®是Invitrogen的商标）。

一、储备溶液的制备

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分为一次性等份，并在制备后在-20°C下储存。避免反复冻融循环。

1.蛋白质原液（溶液A）

将100µL反应缓冲液（例如，1 M碳酸钠溶液或pH~9.0的1 M磷酸盐缓冲液）与900µL目标蛋白质溶液（例如，抗体，蛋白质浓度>2 mg/mL，如果可能）混合，得到1 mL蛋白质标记储备溶液。

注：

1）蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，则使用1 M碳酸氢钠溶液或1 M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调节至8.0-9.0。

2）蛋白质应溶解在1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，pH值为7.2-7.4。如果蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须针对1X PBS（pH 7.2-7.4）进行透析，以去除广泛用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和醋酸铵）。

3）不纯抗体或用牛血清白蛋白（BSA）或明胶稳定的抗体将不能很好地标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰共轭反应。叠氮化钠或硫柳汞可通过透析或旋转柱去除，以获得zui佳的标记结果。

4）如果蛋白质浓度小于2 mg/mL，则接合效率会显著降低。为获得zui佳标记效率，建议zui终蛋白质浓度范围为2-10 mg/mL。

2.荧光灯™ 488硒储备液（溶液B）

将无水二甲基亚砜加入iFluor瓶中™ 350 SE制成10 mM储备溶液。用移液管或旋涡搅拌均匀。

注：开始接合前，制备染料储备溶液（溶液B）。及时使用。染料原液的长期储存可能会降低染料的活性。溶液B在避光防潮的情况下，可在冰箱中保存两周。避免冻融循环。

二、样本实验方案

该标记方案是针对山羊抗鼠IgG与iFluor的结合物而建立的™ 350东南。你可能需要进一步优化你的特定蛋白质。

注：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比率，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记会有害地影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质结合物会降低灵敏度。

运行共轭反应

1.以溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10:1为起点：将5µL染料储备液（溶液B，假设染料储备液为10 mM）加入蛋白溶液（95µL溶液A）小瓶中，有效摇匀。假设蛋白质浓度为10mg/mL且蛋白质的分子量为200KD，则蛋白质的浓度约为0.05mm。

注：我们建议使用10:1摩尔比的溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）。如果太少或太高，确定zui佳染料/蛋白质比分别为5:1、15:1和20:1。

2.在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

纯化结合物

1.以下方案是使用Sephadex G-25柱纯化染料-蛋白质结合物的实例。

2.按照生产说明书制备葡聚糖凝胶G-25柱。

3.将反应混合物（从“运行共轭反应”）装入Sephadex G-25柱顶部。

4.一旦样品刚好在树脂顶面以下，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。

向所需样品中添加更多PBS（pH 7.2-7.4）以完成柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质结合物的部分。

注：

1）为了立即使用，染色蛋白结合物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。

2）为了长期储存，染料-蛋白质结合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。

三、示例数据分析和图表

表征所需的染料-蛋白质结合物

取代度（DOS）是表征染料标记蛋白质的zui重要因素。DOS较低的蛋白质通常具有较弱的荧光强度，但DOS较高的蛋白质（如DOS>6）也倾向于降低荧光强度。大多数抗体的zui佳DOS推荐在2到10之间，这取决于染料和蛋白质的性质。为了有效的标记，取代度应控制在6-8摩尔iFluor™ 350硒相当于一摩尔抗体。以下步骤用于确定iFluor的DOS™ 350硒标记蛋白。

测量吸收率

为了测量染料-蛋白质结合物的吸收光谱，建议根据染料的消光系数将样品浓度保持在1-10µM的范围内。

读取280 nm处的OD（吸光度）和染料zui大吸收（对于iFluor，ƛmax=450 nm）™ 350种染料）

对于大多数分光光度计，样品（来自色谱柱部分）需要用去离子水稀释，以便OD值在0.1到0.9的范围内。280nm处的吸光度是蛋白质的zui大吸收，450nm是荧光的zui大吸收™ 350东南。为了获得准确的DOS，确保共轭物中没有非共轭染料。

计算DOS

Figure 1.HeLa细胞与（微管蛋白+）或不与（微管蛋白-）小鼠抗微管蛋白一起孵育，然后用iFluor™ 488山羊抗鼠IgG结合物（绿色，左侧）或Alexa Fluor®488山羊抗鼠IgG结合物（绿色，右侧）。细胞核用hoechst33342（蓝色）染色。