活性氧(ROS)参与许多退行性神经系统病症,如阿兹海默症、帕金森症、萎缩性脊髓侧索硬化以及年老或外伤导致的脑功能紊乱等。此外活性氧是植物体内正常代谢的信号小分子,在植物的生长发育和抗逆反应中具有重要作用。目前各领域中常见的四种ROS的检测分析方法有:化学发发光法、荧光探针法、分光光度法、电子顺磁共振法。
CheKine™ 活性氧(ROS)检测试剂盒(KTB1910)提供了一种简单、灵敏、快速的ROS检测方法,其原理是利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测。DCFH-DA(二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯)可自由透过活细胞膜进入细胞内,并被细胞内的酯酶水解,形成DCFH,DCFH无荧光且不能通透细胞膜,其可以被细胞内的活性氧(ROS)氧化生成有荧光的DCF,使用流式细胞仪或荧光显微镜检测和观察活细胞内DCF的荧光信号强度,即可以分析细胞活性氧的水平。
CheKine™ 活性氧(ROS)检测试剂盒的操作步骤如下:
对于刺激时间较短(通常为2 h以内)的细胞,建议先装载探针,后用活性氧阳性对照或感兴趣的药物刺激细胞;对于需要较长时间刺激(通常为6 h以上)的细胞,建议先用活性氧阳性对照或感兴趣的药物刺激细胞,后装载探针。
1.原位装载探针 (仅适用于贴壁细胞)
2.收集细胞后装载探针 (适用于贴壁细胞和悬浮细胞)
3.荧光显微拍照
4.流式细胞分析操作方法
注意事项:
1.阳性对照H2O2一般使用浓度为100 μM (推荐浓度50-200 μM,具体依细胞类型而定) 。通常刺激后30 min-4 h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞,活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 min内观察不到活性氧的升高,可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果荧光信号过强,可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
2.实验过程中,如果阴性对照细胞荧光也比较强,可以按照1:2000-1:5000 稀释荧光探针DCFH-DA,使DCFH-DA的终浓度为 2-5 μM。探针装载的时间可在15-60 min 内适当进行调整,尽量缩短读片时的曝光时间,并且试验组、对照组曝光时间需保持一致。
活性氧阳性对照 (H2O2) 仅仅用于作为阳性对照的样品,并非所有试验组样品中都需加入活性氧阳性对照。
3.探针装载后,一定要洗净未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
4.尽量缩短探针装载后到检测所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差。
文章来源:Abbkine
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